質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。在基因工程中，質(zhì)粒制備可將質(zhì)粒作為目的基因的載體，在新的宿主生物體中正常表達(dá)。質(zhì)粒DNA可以作為疫苗或治療性藥物單獨(dú)使用，或在病毒載體生產(chǎn)中作為病毒包裝的原料。

質(zhì)粒制備的步驟

質(zhì)粒制備流程圖

質(zhì)粒制備常見問題

Q：轉(zhuǎn)化后克隆數(shù)量少

A：可以設(shè)置陰性和陽性對(duì)照。克隆過程中，陰性對(duì)照-空載長(zhǎng)出菌落，判定可能是酶切不完全導(dǎo)致，陽性對(duì)照不出斑，可能是轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的操作出現(xiàn)問題。感受態(tài)細(xì)胞切勿反復(fù)凍融，且熱激時(shí)間一定要精準(zhǔn)到秒，同時(shí)正確使用抗生素或其他篩選標(biāo)記。

Q：菌落太多但假陽性率高，挑不到正確克隆

A：菌落PCR鑒定引物需跨區(qū)域設(shè)計(jì)，一條引物設(shè)計(jì)在載體上，另外一條在目標(biāo)片段上。如此可避免假陽性克隆又篩除反向插入片段，還可以通過提取質(zhì)粒酶切跑膠進(jìn)一步排除錯(cuò)誤克隆。

Q：大腸桿菌老化

A：建議涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。

Q：質(zhì)粒未全部溶解

A：洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長(zhǎng)溶解時(shí)間。

Q：質(zhì)粒提取不成功

A：裂解時(shí)間過長(zhǎng)，一般不應(yīng)超過5分鐘。吸附時(shí)間，溶解時(shí)間不夠都會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)失敗。

質(zhì)粒制備|泓迅生物

泓迅生物擁有完善的質(zhì)粒制備生產(chǎn)線，確保提供無RNA污染、無基因組污染的高質(zhì)量無菌質(zhì)粒，可將內(nèi)毒素含量控制在較低水平（< 100EU/mg、<30EU/mg、<5EU/mg，供選擇）。另外我們還提供序列驗(yàn)證、限制酶酶切和內(nèi)毒素分析等服務(wù)，滿足各領(lǐng)域客戶多樣化的下游應(yīng)用，如轉(zhuǎn)染、抗體制備，疫苗和基因治療研究等。

案例分享——轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒制備

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后挑取單克隆菌落進(jìn)行培養(yǎng)，抽提菌液進(jìn)行酶切及測(cè)序驗(yàn)證，對(duì)符合要求的質(zhì)粒進(jìn)行大批量接菌抽提，之后對(duì)各批次抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，無誤后混合所有抽提質(zhì)粒，最后對(duì)大抽質(zhì)粒進(jìn)行去內(nèi)毒素處理，48h細(xì)菌檢測(cè)如圖1所示。

圖1 內(nèi)毒素檢測(cè)

內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果為陰性對(duì)照不凝固，陽性對(duì)照凝固，測(cè)試稀釋樣品不凝固，標(biāo)準(zhǔn)品不凝固，證明去內(nèi)毒素處理成功。

經(jīng)過細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果比對(duì)，48h無抗培養(yǎng)基均不長(zhǎng)斑，通過無菌檢測(cè)。